快讯温医大团队PNAS发表DNA甲基

早筛网讯：近日，温州医科大学检验医学院（生命科学学院）丁春明和金胜男科研团队在国际著名刊物PNAS上发表题为《Efficientdetectionandpost-surgicalmonitoringofcoloncancerwithamulti-markerDNAmethylationliquidbiopsy》的研究论文，该研究通过对临床样本进行大数据分析，筛选出了结直肠癌特异的DNA标志物，同时研发了经济高效、易于临床推广的mqMSP技术，可以在血液中直接检测肠癌特异的DNA，用于肠癌早筛和术后复发的提早预测。大肠癌是世界上发病率和死亡率均排名较高的恶性肿瘤。在中国，大肠癌的发病率和死亡率持续上升。提早发现肠癌是提升癌症病人治愈率和生存的最有效手段。同时，复发转移是患者死亡的主要原因，提早发现或预测肠癌复发能指导临床提早干预，从而改善病人预后。丁春明和金胜男课题组长期专注于基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的转化医学研究。ctDNA由凋亡或坏死的肿瘤细胞释放至体液中，ctDNA的甲基化状态是最有前景的微创生物标志物之一，可用于癌症的早期筛查，辅助诊断和预后评估。但是由于ctDNA在血液中的浓度很低，检测难度较大，通常成本较高，难以临床推广。该团队通过与温附一肠癌研究中心徐昶主任等临床医生近5年的长期合作，对大量肠癌患者进行至少3年以上的随访，独立研发并验证了一种甲基化特异性定量PCR检测技术（methylation-specificquantitativePCRassay,mqMSP）的临床应用价值。在头对头的比较研究中，mqMSP技术在检测I-II期早期肠癌和癌前病变息肉方面优于目前在国内外临床使用的SEPT9技术。在独立纵向队列研究中，使用术后7天内的外周血，mqMSP技术就可以预测55%的复发患者，远远高于目前临床使用的CEA标志物。在持续随访监测过程中，有70％的患者在复发前检测到ctDNA阳性，且比金标准影像学检测提早8.0个月发现肿瘤复发。论文解读首先，由于体液中ctDNA的浓度较低，用ctDNA进行单一生物标记物分析的灵敏度较低，特别是在癌症早期或复发早期患者中，并且DNA甲基化模式存在个体差异，单个标记物可能并不适用于所有人。为了建立一种简单的ctDNA分析方法，研究团队首先筛选了能够在血浆样品中同时定量的多种DNA甲基化标记物。SEPT9基因是位于染色体17q25.3区域的一段基因，其超甲基化可引起结直肠组织癌变。为确定更多的结直肠癌分析亚区，对SEPT9基因启动子的CpG富集区进行DNA甲基化分析，确定了10个子区域（图1A）。基于此，研究团队用两种不同的荧光探针设计了mqMSP检测方法，其中FAM荧光团用于10个子区域，VIC荧光团用于β-Actin（ACTB）对照分析。将10种DNA甲基化标志物的mqMSP与单个标记物的qMSP进行比较，mqMSP分析产生的ΔCq值均比单个的qMSP分析值高，表明多个标记物的分析比单个分析更敏感（图1B）。为了进一步评估mqMSP分析的灵敏度，将甲基化肿瘤组织DNA分别以1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%和0%的比例与buffycoatDNA混合后进行反应分析，每次反应总DNA量固定为10ng。结果表明，基于10种DNA甲基化标志物的mqMSP，可在血样中检测到浓度低至0.05%的ctDNA（图1C）。图1.SEPT9基因内多种DNA甲基化生物标志物的筛选与验证,来源：PNAS接下来，为了测试mqMSP在血浆DNA中检测结直肠癌的能力，研究者招募了53例结直肠癌患者、48例晚期腺瘤患者、30例良性息肉患者和48例健康对照者。在53例结直肠癌患者血样检测中，mqMSP检测的灵敏度为84.9%（45/53）。结直肠癌患者ctDNA甲基化信号明显高于健康对照组，晚期患者（III和IV）比早期患者（I和II）显示出更高的甲基化信号（图2A）。区分结直肠癌患者和对照组的ROC曲线的AUC值为0.（图2B）。图2.血浆ctDNA的mqMSP量化分析,来源：PNAS目前在国内外临床使用的单标记甲基化SEPT9技术可用于基于血液的结直肠癌筛查，早期研究报告了高灵敏度的结直肠癌检测，但样本量相对较小。因此，研究团队对mqMSP和单标记SEPT9分析进行了比较，对份样本（43名结直肠癌患者、15名晚期腺瘤患者、15名良性息肉患者和30名无结直肠癌或息肉的对照组）同时进行分析。结果表明mqMSP和单标记SEPT9检测具有相同的高特异性90%（图3），但mqMSP技术在检测I-II期早期肠癌和癌前病变息肉方面敏感度更高。图3.mqMSP和SEPT9分析的比较,来源：PNAS为了评估mqMSP分析是否可以用于结直肠癌复发检测，研究团队对至少随访了3年的82名患者的份血浆样本（术前、术后和随访）进行了独立纵向队列分析。术前有73例（89.0%）患者检测到ctDNA，术后三年内有20例复发患者。在术后2周内mqMSP成功预测了11例（55%）的复发患者，远远高于目前临床使用的CEA标志物。图4.术后ctDNA的mqMSP测定评估,来源：PNAS最后，研究团队评估了19名患者的随访血浆ctDNA分析是否能进一步改善复发预测。在7名复发患者中，4名患者术后血浆检测呈阳性，另外2名患者在随访血浆样本中检测呈阳性，结果表明纵向ctDNA分析可提高预测复发的敏感性（图5）。总的来说，在持续随访监测过程中，有70％的患者在复发前检测到ctDNA阳性，且mqMSP对ctDNA的分析能够比影像学检测早8个月发现肿瘤复发。图5.mqMSP对预测复发的进一步评估,来源：PNAS综上所述，该研究团队筛选出了结直肠癌特异的DNA标志物，同时研发了经济高效、易于临床推广的mqMSP技术，可以在血液中直接检测肠癌特异DNA，从而为肠癌早筛和肠癌术后复发的提早预测提供了临床应用价值。据悉，温医大检验医学院（生命科学学院）丁春明研究员为本论文的通讯作者，金胜男研究员为第一作者兼共同通讯作者，温州医院肛肠外科的徐昶医生和美国波士顿大学的CharlesR.Cantor教授为本文的共同通讯作者，博士生朱德雯和邵方桂为共同第一作者。该项工作得到了国家自然科学基金，浙江省领军型创新创业团队，温州市科学技术局重大科技专项等经费的支持。丁春明教授简介

丁春明，男，博士，研究员，博士生导师，博士后合作导师，国家浙江省重要人才。现任温州医科大学检验医学院（生命科学学院）院长、检验医学教育部重点实验室主任、浙江省医学遗传学重点实验室副主任、中国细胞生物学学会医学分会第五届委员会委员、浙江省细胞生物学学会第七届理事会理事、浙江省临床检验中心专家委员会委员。曾任新加坡临床研究所研究员（PI）、表观遗传中心主任、香港中文大学医学院助理教授等。

主要从事分子诊断的临床应用研究，致力于外周血游离核酸生物标记物（胎儿，肿瘤）的原创性研究和临床应用，现已在Science，NatureMedicine，NatureBiotechnology，CellStemCell，PNAS，PloSGenetics等国际著名学术期刊发表了40多篇SCI论文，其中本人为第一作者或通讯作者的SCI论文26篇，SCI影响因子累计超过，引用超过次。已授权专利70余项，其中美国专利21项，中国专利10项。曾在美国，香港，新加坡主持（PI）项目5项，co-PI项目6项。

代表性论文：

1.DingChunming,LimYenChing,etal.DenovoreconstructionofhumanadiposetranscriptomerevealsconservedlncRNAsasregulatorsofbrownadipogenesis[J].NatureCommunications,9(1)():.

2.JinShengnan,ShangQingjuan,etal.,MinghuaJiang,DingChunming.AClosed-TubeNestedQuantitativePCRAssayforRapidDetectionofIntron22InversionsintheFactorVIIIGene[J].ClinicalChemistry,66(2)():-.

3.ShengnanJin,QianYe,etal.,ChangXu*andChunmingDing*.AsystematicevaluationofstoolDNApreparationprotocolsforcolorectalcancerscreeningviaanalysisofDNAmethylationbiomarkers[J].ClinicalChemistryandLaboratoryMedicine,aheadofprint(),DOI:

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